Визначення вільного трийодтироніну ґрунтується на використанні конкурентного імуноферментного аналізу. На внутрішній поверхні лунок планшета іммобілізовані кролячі поліклональні антитіла проти T3. Вільний трийодтиронін зі зразка конкурує з кон’югованим Т3 за зв’язування з антитілами на поверхні лунки. У результаті утворюється зв’язаний з твердою фазою комплекс, що містить пероксидазу. Під час інкубації з розчином субстрату тетраметилбензидину (ТМБ) рідина в лунках забарвлюється.

Інтенсивність забарвлення обернено пропорційна концентрації вільного трийодтироніну в досліджуваному зразку. Концентрацію вільного трийодтироніну в досліджуваних зразках визначають за калібрувальним графіком залежності оптичної густини від вмісту вільного трийодтироніну в калібрувальних пробах.