Визначення естрадіолу ґрунтується на використанні конкурентного імуноферментного аналізу. На внутрішній поверхні лунок планшета іммобілізовані кролячі поліклональні антитіла проти естрадіолу. Естрадіол зі зразка конкурує з кон’югованим естрадіолом за зв’язування з антитілами на поверхні лунки.

У результаті утворюється зв’язаний із твердою фазою комплекс, що містить пероксидазу. Під час інкубації з розчином субстрату тетраметилбензидину (ТМБ) рідина в лунках забарвлєються. Інтенсивність забарвлення обернено пропорційна концентрації естрадіолу в досліджуваному зразку.

Концентрацію естрадіолу в досліджуваних зразках визначають за калібрувальним графіком залежності оптичної густини від вмісту естрадіолу в калібрувальних пробах.