Визначення вільного кортизолу ґрунтується на використанні конкурентного імуноферментного
аналізу. На внутрішній поверхні лунок планшета іммобілізовані мишачі моноклональні антитіла проти
кортизолу. Вільний кортизол зі зразка конкурує з кон’югованим кортизолом за зв’язування з антитілами на
поверхні лунки.

У результаті утворюється зв’язаний із твердрю фазою комплекс, що містить пероксидазу.
Під час інкубації з розчином субстрату тетраметилбензидину (ТМБ) рідина в лунках забарвлюється.
Інтенсивність забарвлення обернено пропорційна концентрації вільного кортизолу в досліджуваному зразку.
Концентрацію вільного кортизолу в досліджуваних зразках визначають за калібрувальним графіком
залежності оптичної густини від вмісту вільного кортизолу в калібрувальних пробах.