Визначення кортизолу ґрунтується на використанні конкурентного варіанта твердофазного імуноферментного аналізу. На внутрішній поверхні лунок планшета іммобілізовані мишачі моноклональні антитіла проти кортизолу.

Кортизол зі зразка конкурує з кон’югованим кортизолом за зв’язування з антитілами на поверхні лунки. У результаті утворюється зв’язаний із твердою фазою комплекс, що містить пероксидазу. Під час інкубації з розчином субстрату тетраметилбензидину (ТМБ) рідина в лунках забарвлюється.

Інтенсивність забарвлення обернено пропорційна концентрації кортизолу в досліджуваному зразку. Концентрацію кортизолу в досліджуваних зразках визначають за калібрувальним графіком залежності оптичної густини від вмісту кортизолу в калібрувальних пробах.