Визначення CA 72-4 ґрунтується на використанні «сендвіч»-варіанта твердофазного імуноферментного аналізу. На внутрішній поверхні лунок планшета іммобілізовані мишачі моноклональні антитіла проти CA 72-4 людини. У лунках планшета, при додаванні досліджуваного зразка, відбувається зв’язування CA 72-4, що міститься в досліджуваному зразку, з антитілами на твердій фазі.

Комплекс, що утворився, виявляють за допомогою кон’югату мишачих моноклональних антитіл проти CA 72-4 людини з пероксидазою хріну. В результаті утворюється зв’язаний з твердою фазою «сендвіч», що містить пероксидазу. Під час інкубації з розчином субстрату тетраметилбензидину (ТМБ) рідина в лунках забарвлюється.

Інтенсивність забарвлення прямо пропорційна концентрації CA 72-4 в досліджуваному зразку. Концентрацію CA 72-4 в досліджуваних зразках визначають за калібрувальним графіком залежності оптичної густини від вмісту CA 72-4 в калібрувальних пробах.