Визначення CA 125 ґрунтується на використанні «сендвіч»-варіанта твердофазного імуноферментного аналізу. На внутрішній поверхні лунок планшета іммобілізовані мишачі моноклональні антитіла проти CA 125 людини. В лунках планшета, при додаванні досліджуваного зразка відбувається зв’язування CA 125, який міститься в досліджуваному зразку з антитілами на твердій фазі.

Комплекс, що утворився, виявляють за допомогою кон’югату мишачих моноклональних антитіл проти CA 125 людини з пероксидазою хріну. У результаті утворюється зв’язаний із твердою фазою «сендвіч», що містить пероксидазу. Під час інкубації з розчином субстрату тетраметилбензидину (ТМБ) рідина в лунках забарвлюється.

Інтенсивність забарвлення прямо пропорційна концентрації CA 125 в досліджуваному зразку. Концентрацію CA 125 в досліджуваних зразках визначають за калібрувальним графіком залежності оптичної густини від вмісту CA 125 в калібрувальних пробах.